尊龙凯时细胞培养指南

培养条件

气相条件：95%空气 + 5%二氧化碳，温度设定为37℃。

传代方法

首次传代建议比例为1:2，传代后应在2天内更换培养液。建议同时购买尊龙凯时细胞培养产品，以享受更优惠的价格。在收到细胞后，请尽快进行处理，培养至良好状态，然后采用完全培养液灌满瓶口并封闭，确保细胞运输安全。

细胞处理步骤

收到细胞后，首先用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后在超净台内进行无菌操作。将细胞瓶放置在37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以便稳定细胞状态后再进行处理。利用显微镜观察细胞生长情况，记录并保存不同倍数下的照片（建议40x, 100x, 200x各一张），前三天的照片将作为售后服务的重要依据，如果未提供照片，将默认收到的状态良好。

细胞培养步骤

细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，则将瓶内的完全培养液转移至离心管中，保留5ml，放入37℃、5% CO2的孵箱中培养；若细胞密度超过80%，即可进行传代培养。

贴壁细胞传代步骤：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS轻洗细胞1-2次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态，若大部分细胞变圆并脱落，则迅速轻敲培养瓶并加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。

悬浮细胞传代步骤：

1. 采用半换液法，竖着放置培养瓶，在培养箱中静置约1小时，轻轻吸去3ml左右的培养基，然后补充3ml的完全培养基。
2. 如需分瓶，可将细胞悬液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后重悬，再按1:2的比例分装至新的T25瓶中，确保细胞生长活力。

细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液并用PBS清洗细胞。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞回缩现象，待细胞变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使其脱落，转移至15ml离心管中并1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管。
4. 将冻存的细胞直接放入-80℃冰箱中，如果后续需要转入液氮罐中，则需在-80℃中存放24小时以上后再转入液氮罐。

细胞复苏

1. 小心取出液氮中的细胞冻存管（佩戴防护面具），迅速放入37℃水浴中解冻，直到冻存管内无结晶，然后用75%的酒精擦拭管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清后，用5ml完全培养基重悬，并接种至T25培养瓶，放置于37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。
4. 次日更换新鲜完全培养基以延续细胞的生长。

注意事项

部分细胞可能因贴壁不牢，在运输过程中容易发生脱落，这属于正常现象。如果脱落较多，可以将培养瓶内所有培养液收集至离心管中进行处理，1000RPM离心5分钟，收集上清用于过渡培养。沉淀后加入胰酶1-2ml，轻轻吹打后继续处理。最后，再按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO2的培养箱中进行培养，以确保良好的细胞生长状态。

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